一、前言

莫西沙星（moxifloxacin）是一种新型超广谱喹诺酮类抗菌药，对革兰阳性菌、革兰阴性菌、衣原体和支原体均有良好的抗菌活性。因其具有抗菌性强、抗菌谱广、不良反应少等特点，在临床上被广泛应用于治疗金黄色葡萄球菌、流感杆菌、肺炎球菌等引起的获得性肺炎、慢性支气管炎、急性咽炎、急性鼻窦炎以及急性扁桃体炎等。

RC-4杂质是一种莫西沙星降解杂质，也是盐酸莫西沙星滴眼液中的特定已知杂质。目前因为该杂质生产困难且无稳定供应商，给莫西沙星的质量研究工作造成一定阻碍。为此，我们针对这个难点开展了系列研究，最终通过制备分离的方式获得了该杂质，纯度大于95%。

图1.莫西沙星及其氧化降解杂质RC-4

二、实验部分

2.1 试剂

乙腈：HPLC级；

磷酸盐：HPLC级；

水：超纯水

2.2仪器及耗材

制备液相：SHIMADZU LC-20AP

制备柱：YMC-Actus Triart C18，250×20.0mm，5um，12nm

三、结果

3.1色谱条件的确定

在前期实验中，我们以莫西沙星加速稳定性样品作为制备原料，通过筛选色谱柱，优化制备条件，最终确定了RC-4的分离方法。如图2所示，RC-4于RT 18.9 min流出，峰形及分离度良好，无肩峰与拖尾峰，可在此条件下与其他物质有效分离。

图2.处理后的莫西沙星样品在制备液相中的色谱图

3.2上样量的选择

为了考察进样量对分离效果的影响，如图3所示，我们测试了进样量为1.5mL（蓝色）、3mL（红色）和5mL（黑色）下的分离情况。随着进样量的增大，RC-4峰变宽，但仍然维持了较好的峰形且分离度良好，未发生过载现象。因此，为了提高制备效率，我们在后续工作中，使用最大进样量（5mL）开展分离工作。

图3.相同条件下不同进样量的莫西沙星在制备液相中的图谱

3.3馏分收集方式的选择

我们通过调节仪器的采集斜率和采集时间等参数，最终实现了全自动采集，如图4所示，在该条件下，FRC（Fraction Collecter）准确的收集了RC-4组分。

此外，如图5所示，通过LC-20AP配备的大馏分收集部件，我们将RT 18.9 min附近的馏分收集并直接储存到2L溶剂瓶中。理论上该大馏分收集装置可以满足多组分长序列的制备分离工作，避免了使用常规试管收集所带来的不便。

图4.FRC组分收集报告图

图5.LC-20AP大馏分收集装置

3.4 仪器、色谱柱及方法的重现性

在制备过程中，我们对同一序列中的图谱进行随机抽样对比，如图6所示，在相同条件下，RC-4杂质的峰形及保留时间重现性良好（RT 18.9 min）。

图6.同一序列中随机抽取的十份色谱图对比

最终，如图7所示，我们将收集到的组分通过高分辨质谱进行分析，确认其为RC-4杂质，含量可达98.5%（图8）。此外，由于系统的重现性良好，上述方法可在无人值守的工况下连续工作36小时（与流动相容器体积有关），大大提高了分离效率。

图7. RC-4杂质高分辨质谱图

图8.RC-4收集组分纯度图

3.5 结论

综上，我们通过SHIMADZU LC-20AP制备液相对莫西沙星加速稳定性样品中的RC-4杂质进行了分离纯化，最终得到了高纯度杂质对照品（95%以上）。此外，该方法及硬件体系稳定、可控，可以全自动运行，大大提高了分离制备的效率。